Ускоренная пробоподготовка образцов для точного количественного протеомного анализа клеток и тканей методом ультрабыстрой масс-спектрометрии

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Современные достижения в области жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС1) сделали возможным проведение полнопротеомного количественного анализа за минуты, достигая производительности до 1000 анализов в сутки. В связи с этим актуален пересмотр подходов к пробоподготовке для протеомики, соответственно скорости анализа ВЭЖХ-МС1. Несмотря на существование методов ускоренной пробоподготовки в течение десятилетий, их применение в количественной сверхбыстрой протеомике и комплексное сравнение эффективности до настоящего времени не исследовались. В данной работе проведено сравнение методов ускоренного восстановления, алкилирования и гидролиза белков с помощью ультразвукового, микроволнового излучений и при повышенной температуре. Валидация выполнена с использованием количественного анализа без меток протеомов Saccharomyces cerevisiae, клеточных линий человека и побегов озимой пшеницы методами ВЭЖХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС1 без спектров фрагментации (метод DirectMS1). Все эксперименты проводились с использованием коротких хроматографических градиентов от 5 до 16 мин. Для оценки точности количественного анализа использовались количественные стандарты – смеси белков человека и дрожжей. Полученные результаты демонстрируют, что сокращение времени пробоподготовки не влияет на воспроизводимость идентификаций пептидов и белков, несмотря на снижение эффективности восстановления, алкилирования и ферментативного гидролиза белков. Также было обнаружено, что ферментативный гидролиз в течение 30 мин при СВЧ-воздействии и классический 18-часовой гидролиз обеспечили сопоставимую точность количественного анализа при сверхбыстром анализе методом DirectMS1.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Д. Д. Емекеева

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

Т. Т. Кусаинова

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

Л. А. Гарибова

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

А. А. Шелепчиков

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 123022 Москва

А. С. Кононихин

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

А. В. Третьяков

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 123022 Москва

О. И. Лаврухина

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 123022 Москва

Е. Н. Николаев

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

М. В. Горшков

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

И. А. Тарасова

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе

Автор, ответственный за переписку.
Email: iatarasova@yandex.ru
Россия, 119334 Москва

Список литературы

  1. Rayaprolu, S., Higginbotham, L., Bagchi, P., Watson, C. M., Zhang, T., Levey, A. I., Rangaraju, S., and Seyfried, N. T. (2021) Systems-based proteomics to resolve the biology of Alzheimer’s disease beyond amyloid and tau, Neuropsychopharmacology, 46, 98-115, https://doi.org/10.1038/s41386-020-00840-3.
  2. Johnson, E. C. B., Dammer, E. B., Duong, D. M., Ping, L., Zhou, M., Yin, L., Higginbotham, L. A., Guajardo, A., White, B., Troncoso, J. C., Thambisetty, M., Montine, T. J., Lee, E. B., Trojanowski, J. Q., Beach, T. G., Reiman, E. M., Haroutunian, V., Wang, M., Schadt, E., Zhang, B., Dickson, D. W., Ertekin-Taner, N., Golde, T. E., Petyuk, V. A., De Jager, P. L., Bennett, D. A., Wingo, T. S., Rangaraju, S., Hajjar, I., Shulman, J. M., Lah, J. J., Levey, A. I., and Seyfried, N. T. (2020) Large-scale proteomic analysis of Alzheimer’s disease brain and cerebrospinal fluid reveals early changes in energy metabolism associated with microglia and astrocyte activation, Nat. Med., 26, 769-780, https://doi.org/10.1038/s41591-020-0815-6.
  3. Amiri-Dashatan, N., Koushki, M., Abbaszadeh, H.-A., Rostami-Nejad, M., and Rezaei-Tavirani, M. (2018) Proteomics applications in health: biomarker and drug discovery and food industry, Iran. J. Pharm. Res., 17, 1523-1536.
  4. Purvine, S., Eppel, J.-T., Yi, E. C., and Goodlett, D. R. (2003) Shotgun collision-induced dissociation of peptides using a time of flight mass analyzer, Proteomics, 3, 847-850, https://doi.org/10.1002/pmic.200300362.
  5. Michalski, A., Cox, J., and Mann, M. (2011) More than 100,000 detectable peptide species elute in single shotgun proteomics runs but the majority is inaccessible to data-dependent LC-MS/MS, J. Proteome Res., 10, 1785-1793, https://doi.org/10.1021/pr101060v.
  6. Thompson, A., Schäfer, J., Kuhn, K., Kienle, S., Schwarz, J., Schmidt, G., Neumann, T., Johnstone, R., Mohammed, A. K. A., and Hamon, C. (2003) Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS, Anal. Chem., 75, 1895-1904, https://doi.org/10.1021/ac0262560.
  7. Fedorov, I. I., Protasov, S. A., Tarasova, I. A., and Gorshkov, M. V. (2024) Ultrafast proteomics, Biochemistry (Moscow), 89, 1349-1361, https://doi.org/10.1134/S0006297924080017.
  8. Nakayasu, E. S., Gritsenko, M., Piehowski, P. D., Gao, Y., Orton, D. J., Schepmoes, A. A., Fillmore, T. L., Frohnert, B. I., Rewers, M., Krischer, J. P., Ansong, C., Suchy-Dicey, A. M., Evans-Molina, C., Qian, W.-J., Webb-Robertson, B.-J. M., and Metz, T. O. (2021) Tutorial: best practices and considerations for mass-spectrometry-based protein biomarker discovery and validation, Nat. Protoc., 16, 3737-3760, https://doi.org/10.1038/s41596-021-00566-6.
  9. Wang, M., Beckmann, N. D., Roussos, P., Wang, E., Zhou, X., Wang, Q., Ming, C., Neff, R., Ma, W., Fullard, J. F., Hauberg, M. E., Bendl, J., Peters, M. A., Logsdon, B., Wang, P., Mahajan, M., Mangravite, L. M., Dammer, E. B., Duong, D. M., Lah, J. J., Seyfried, N. T., Levey, A. I., Buxbaum, J. D., Ehrlich, M., Gandy, S., Katsel, P., Haroutunian, V., Schadt, E., and Zhang, B. (2018) The mount Sinai cohort of large-scale genomic, transcriptomic and proteomic data in Alzheimer’s disease, Sci. Data, 5, 180-185, https://doi.org/10.1038/sdata.2018.185.
  10. Ivanov, M. V., Bubis, J. A., Gorshkov, V., Tarasova, I. A., Levitsky, L. I., Lobas, A. A., Solovyeva, E. M., Pridatchenko, M. L., Kjeldsen, F., and Gorshkov, M. V. (2020) DirectMS1: MS/MS-free identification of 1000 proteins of cellular proteomes in 5 minutes, Anal. Chem., 92, 4326-4333, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b05095.
  11. Ivanov, M. V., Bubis, J. A., Gorshkov, V., Tarasova, I. A., Levitsky, L. I., Solovyeva, E. M., Lipatova, A. V., Kjeldsen, F., and Gorshkov, M. V. (2022) DirectMS1Quant: ultrafast quantitative proteomics with MS/MS-Free mass spectrometry, Anal. Chem., 94, 13068-13075, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c02255.
  12. Kusainova, T. T., Emekeeva, D. D., Kazakova, E. M., Gorshkov, V. A., Kjeldsen, F., Kuskov, M. L., Zhigach, A. N., Olkhovskaya, I. P., Bogoslovskaya, O. A., Glushchenko, N. N., and Tarasova, I. A. (2023) Ultra-fast mass spectrometry in plant biochemistry: response of winter wheat proteomics to pre-sowing treatment with iron compounds, Biochemistry (Moscow), 88, 1390-1403, https://doi.org/10.1134/S0006297923090183.
  13. Kazakova, E., Ivanov, M., Kusainova, T., Bubis, J., Polivtseva, V., Petrikov, K., Gorshkov, V., Kjeldsen, F., Gorshkov, M., Delegan, Y., Solyanikova, I., and Tarasova, I. (2024) Ultrafast metaproteomics for quantitative assessment of strain isolates and microbiomes, Microchem. J., 207, 111823, https://doi.org/10.1016/j.microc.2024.111823.
  14. Kazakova, E. M., Solovyeva, E. M., Levitsky, L. I., Bubis, J. A., Emekeeva, D. D., Antonets, A. A., Nazarov, A. A., Gorshkov, M. V., and Tarasova, I. A. (2023) Proteomics-based scoring of cellular response to stimuli for improved characterization of signaling pathway activity, Proteomics, 23, e2200275, https://doi.org/10.1002/pmic.202200275.
  15. Solovyeva, E. M., Bubis, J. A., Tarasova, I. A., Lobas, A. A., Ivanov, M. V., Nazarov, A. A., Shutkov, I. A., and Gorshkov, M. V. (2022) On the feasibility of using an ultra-fast DirectMS1 method of proteome-wide analysis for searching drug targets in chemical proteomics, Biochemistry (Moscow), 87, 1342-1353, https://doi.org/10.1134/S000629792211013X.
  16. Fedorov, I. I., Bubis, J. A., Kazakova, E. M., Lobas, A. A., Ivanov, M. V., Emekeeva, D. D., Tarasova, I. A., Nazarov, A. A., and Gorshkov, M. V. (2024) On the utility of ultrafast MS1-only proteomics in drug target discovery studies based on thermal proteome profiling method, Anal. Bioanal. Chem., 416, 4083-4089, https://doi.org/10.1007/s00216-024-05330-9.
  17. Fedorov, I. I., Ivanov, M. V., and Gorshkov, M. V. (2025) Effect of drug-to-protein reaction kinetics on the results of thermal proteome profiling, Anal. Chem., 97, 22-26, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c04313.
  18. Müller, T., and Winter, D. (2017) Systematic evaluation of protein reduction and alkylation reveals massive unspecific side effects by iodine-containing reagents, Mol. Cell. Proteomics, 16, 1173-1187, https://doi.org/10.1074/mcp.M116.064048.
  19. Varnavides, G., Madern, M., Anrather, D., Hartl, N., Reiter, W., and Hartl, M. (2022) In search of a universal method: a comparative survey of bottom-up proteomics sample preparation methods, J. Proteome Res., 21, 2397-2411, https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.2c00265.
  20. Poulsen, J. W., Madsen, C. T., Young, C., Poulsen, F. M., and Nielsen, M. L. (2013) Using guanidine-hydrochloride for fast and efficient protein digestion and single-step affinity-purification mass spectrometry, J. Proteome Res., 12, 1020-1030, https://doi.org/10.1021/pr300883y.
  21. Loraine, J., Alhumaidan, O., Bottrill, A. R., Mistry, S. C., Andrew, P., Mukamolova, G. V., and Turapov, O. (2019) Efficient protein digestion at elevated temperature in the presence of sodium dodecyl sulfate and calcium ions for membrane proteomics, Anal. Chem., 91, 9516-9521, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00484.
  22. Wang, Y., Zhang, W., and Ouyang, Z. (2020) Fast protein analysis enabled by high-temperature hydrolysis, Chem. Sci., 11, 10506-10516, https://doi.org/10.1039/D0SC03237A.
  23. Santos, H. M., Kouvonen, P., Capelo, J.-L., and Corthals, G. L. (2013) On-target ultrasonic digestion of proteins, Proteomics, 13, 1423-1427, https://doi.org/10.1002/pmic.201200241.
  24. López-Ferrer, D., Capelo, J. L., and Vázquez, J. (2005) Ultra fast trypsin digestion of proteins by high intensity focused ultrasound, J. Proteome Res., 4, 1569-1574, https://doi.org/10.1021/pr050112v.
  25. Wang, S., Bao, H., Zhang, L., Yang, P., and Chen, G. (2008) Infrared-assisted on-plate proteolysis for MALDI-TOF-MS peptide mapping, Anal. Chem., 80, 5640-5647, https://doi.org/10.1021/ac800349u.
  26. Chen, Z., Li, Y., Lin, S., Wei, M., Du, F., and Ruan, G. (2014) Development of continuous microwave-assisted protein digestion with immobilized enzyme, Biochem. Biophys. Res. Commun., 445, 491-496, https://doi.org/ 10.1016/j.bbrc.2014.02.025.
  27. Lill, J. R., and Nesatyy, V. J. (2018) Microwave-assisted protein staining, destaining, and in-gel/in-solution digestion of proteins, Methods Mol. Biol., 1853, 75-86, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8745-0_10.
  28. Hustoft, H. K., Malerod, H., Wilson, S. R., Reubsaet, L., Lundanes, E., Greibrokk, T., Hustoft, H. K., Malerod, H., Wilson, S. R., Reubsaet, L., Lundanes, E., and Greibrokk, T. (2012) A Critical review of trypsin digestion for LC-MS based proteomics, Integr. Proteom., https://doi.org/10.5772/29326, doi: 10.5772/29326.
  29. Switzar, L., Giera, M., and Niessen, W. M. A. (2013) Protein digestion: an overview of the available techniques and recent developments, J. Proteome Res., 12, 1067-1077, https://doi.org/10.1021/pr301201x.
  30. Sun, W., Gao, S., Wang, L., Chen, Y., Wu, S., Wang, X., Zheng, D., and Gao, Y. (2006) Microwave-assisted protein preparation and enzymatic digestion in proteomics, Mol. Cell. Proteomics, 5, 769-776, https://doi.org/10.1074/mcp.T500022-MCP200.
  31. Shen, L., Zhang, Z., Wu, P., Yang, J., Cai, Y., Chen, K., Chai, S., Zhao, J., Chen, H., Dai, X., Yang, B., Wei, W., Dong, L., Chen, J., Jiang, P., Cao, C., Ma, C., Xu, C., Zou, Y., Zhang, J., Xiong, W., Li, Z., Xu, S., Shu, B., Wang, M., Li, Z., Wan, Q., Xiong, N., and Chen, S. (2024) Mechanistic insight into glioma through spatially multidimensional proteomics, Sci. Adv., 10, eadk1721, https://doi.org/10.1126/sciadv.adk1721.
  32. Sivakova, B., Wagner, A., Kretova, M., Jakubikova, J., Gregan, J., Kratochwill, K., Barath, P., and Cipak, L. (2024) Quantitative proteomics and phosphoproteomics profiling of meiotic divisions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Sci. Rep., 14, 23105, https://doi.org/10.1038/s41598-024-74523-0.
  33. Tang, Y., and Gu, Y. (2025) Unraveling plant nuclear envelope composition using proximity labeling proteomics, Methods Mol. Biol., 2873, 145-165, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-4228-3_9.
  34. Zeng, X., Wei, T., Wang, X., Liu, Y., Tan, Z., Zhang, Y., Feng, T., Cheng, Y., Wang, F., Ma, B., Qin, W., Gao, C., Xiao, J., and Wang, C. (2024) Discovery of metal-binding proteins by thermal proteome profiling, Nat. Chem. Biol., 20, 770-778, https://doi.org/10.1038/s41589-024-01563-y.
  35. Sang, T., Xu, Y., Qin, G., Zhao, S., Hsu, C.-C., and Wang, P. (2024) Highly sensitive site-specific SUMOylation proteomics in Arabidopsis, Nat. Plants, 10, 1330-1342, https://doi.org/10.1038/s41477-024-01783-z.
  36. Pirmoradian, M., Budamgunta, H., Chingin, K., Zhang, B., Astorga-Wells, J., and Zubarev, R. A. (2013) Rapid and deep human proteome analysis by single-dimension shotgun proteomics, Mol. Cell. Proteomics, 12, 3330-3338, https://doi.org/10.1074/mcp.O113.028787.
  37. Wang, H., Yang, Y., Li, Y., Bai, B., Wang, X., Tan, H., Liu, T., Beach, T. G., Peng, J., and Wu, Z. (2015) Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome, J. Proteome Res., 14, 829-838, https://doi.org/10.1021/pr500882h.
  38. Richards, A. L., Hebert, A. S., Ulbrich, A., Bailey, D. J., Coughlin, E. E., Westphall, M. S., and Coon, J. J. (2015) One-hour proteome analysis in yeast, Nat. Protoc., 10, 701-714, https://doi.org/10.1038/nprot.2015.040.
  39. Nie, L., Zhu, M., Sun, S., Zhai, L., Wu, Z., Qian, L., and Tan, M. (2015) An optimization of the LC-MS/MS workflow for deep proteome profiling on an Orbitrap Fusion, Anal. Methods, 8, 425-434, https://doi.org/10.1039/C5AY01900A.
  40. Moshkovskii, S. A., Lobas, A. A., and Gorshkov, M. V. (2020) Single cell proteogenomics – immediate prospects, Biochemistry (Moscow), 85, 140-146, https://doi.org/10.1134/S0006297920020029.
  41. Ahmad, R., and Budnik, B. (2023) A review of the current state of single-cell proteomics and future perspective, Anal. Bioanal. Chem., 415, 6889-6899, https://doi.org/10.1007/s00216-023-04759-8.
  42. Sinn, L. R., and Demichev, V. (2025) Entering the era of deep single-cell proteomics, Nat. Methods, 22, 459-460, https://doi.org/10.1038/s41592-025-02620-7.
  43. Bennett, H. M., Stephenson, W., Rose, C. M., and Darmanis, S. (2023) Single-cell proteomics enabled by next-generation sequencing or mass spectrometry, Nat. Methods, 20, 363-374, https://doi.org/10.1038/s41592-023-01791-5.
  44. Bubis, J. A., Arrey, T. N., Damoc, E., Delanghe, B., Slovakova, J., Sommer, T. M., Kagawa, H., Pichler, P., Rivron, N., Mechtler, K., and Matzinger, M. (2025) Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity, Nat. Methods, 22, 510-519, https://doi.org/10.1038/s41592-024-02559-1.
  45. Savitski, M. M., Reinhard, F. B. M., Franken, H., Werner, T., Savitski, M. F., Eberhard, D., Martinez Molina, D., Jafari, R., Dovega, R. B., Klaeger, S., Kuster, B., Nordlund, P., Bantscheff, M., and Drewes, G. (2014) Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome, Science, 346, 1255784, https://doi.org/10.1126/science.1255784.
  46. Fedorov, I. I., Lineva, V. I., Tarasova, I. A., and Gorshkov, M. V. (2022) Mass spectrometry-based chemical proteomics for drug target discoveries, Biochemistry (Moscow), 87, 983-994, https://doi.org/10.1134/ S0006297922090103.
  47. Bubis, J. A., Spasskaya, D. S., Gorshkov, V. A., Kjeldsen, F., Kofanova, A. M., Lekanov, D. S., Gorshkov, M. V., Karpov, V. L., Tarasova, I. A., and Karpov, D. S. (2020) Rpn4 and proteasome-mediated yeast resistance to ethanol includes regulation of autophagy, Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 4027-4041, https://doi.org/10.1007/ s00253-020-10518-x.
  48. Wessel, D., and Flügge, U. I. (1984) A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids, Anal. Biochem., 138, 141-143, https://doi.org/10.1016/0003-2697(84)90782-6.
  49. Emekeeva, D., Kusainova, T., Garibova, L., and Tarasova, I. A. (2024) DirectMS1 Ultrafast proteomics: protein extraction & digestion, Protocols.io, https://doi.org/10.17504/protocols.io.261gernowl47/v1.
  50. Hulstaert, N., Shofstahl, J., Sachsenberg, T., Walzer, M., Barsnes, H., Martens, L., and Perez-Riverol, Y. (2020) ThermoRawFileParser: modular, scalable, and cross-platform RAW File conversion, J. Proteome Res., 19, 537-542, https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00328.
  51. Abdrakhimov, D. A., Bubis, J. A., Gorshkov, V., Kjeldsen, F., Gorshkov, M. V., and Ivanov, M. V. (2021) Biosaur: An open-source Python software for liquid chromatography-mass spectrometry peptide feature detection with ion mobility support, Rapid Commun. Mass Spectrom., e9045, https://doi.org/10.1002/rcm.9045.
  52. Ivanov, M. V., Bubis, J. A., Gorshkov, V., Abdrakhimov, D. A., Kjeldsen, F., and Gorshkov, M. V. (2021) Boosting MS1-only proteomics with machine learning allows 2000 protein identifications in single-shot human proteome analysis using 5 min HPLC gradient, J. Proteome Res., 20, 1864-1873, https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.0c00863.
  53. Elias, J. E., and Gygi, S. P. (2010) Target-decoy search strategy for mass spectrometry-based proteomics, Methods Mol. Biol., 604, 55-71, https://doi.org/10.1007/978-1-60761-444-9_5.
  54. Levitsky, L. I., Ivanov, M. V., Lobas, A. A., Bubis, J. A., Tarasova, I. A., Solovyeva, E. M., Pridatchenko, M. L., and Gorshkov, M. V. (2018) IdentiPy: an extensible search engine for protein identification in shotgun proteomics, J. Proteome Res., 17, 2249-2255, https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.7b00640.
  55. Ivanov, M. V., Levitsky, L. I., Bubis, J. A., and Gorshkov, M. V. (2019) Scavager: a versatile postsearch validation algorithm for shotgun proteomics based on gradient boosting, Proteomics, 19, e1800280, https://doi.org/10.1002/pmic.201800280.
  56. Zybailov, B., Mosley, A. L., Sardiu, M. E., Coleman, M. K., Florens, L., and Washburn, M. P. (2006) Statistical analysis of membrane proteome expression changes in Saccharomyces cerevisiae, J. Proteome Res., 5, 2339-2347, https://doi.org/10.1021/pr060161n.
  57. Ivanov, M. V., Kopeykina, A. S., and Gorshkov, M. V. (2024) Reanalysis of DIA data demonstrates the capabilities of MS/MS-free proteomics to reveal new biological insights in disease-related samples, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 35, 1775-1785, https://doi.org/10.1021/jasms.4c00134.
  58. Bubis, J. A., Gorshkov, V., Gorshkov, M. V., and Kjeldsen, F. (2020) PhosphoShield: improving trypsin digestion of phosphoproteins by shielding the negatively charged phosphate moiety, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 31, 2053-2060, https://doi.org/10.1021/jasms.0c00171.
  59. Tuli, L., and Ressom, H. W. (2009) LC-MS based detection of differential protein expression, J. Proteomics Bioinform., 2, 416-438, https://doi.org/10.4172/jpb.1000102.
  60. Hahn, H. W., Rainer, M., Ringer, T., Huck, C. W., and Bonn, G. K. (2009) Ultrafast microwave-assisted in-tip digestion of proteins, J. Proteome Res., 8, 4225-4230, https://doi.org/10.1021/pr900188x.
  61. Devi, S., Wu, B.-H., Chu, P.-Y., Liu, Y.-P., Wu, H.-L., and Ho, Y.-P. (2017) Studying the effect of microwave heating on the digestion process and identification of proteins, Electrophoresis, 38, 429-440, https://doi.org/ 10.1002/elps.201600392.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. SDS-PAGE для верификации ускоренных протоколов гидролиза. а – Клеточная линия человека A549; б – побеги 7-дневных проростков пшеницы T. aestivum; в – пекарские дрожжи S. cerevisiae. Обозначения: М – маркеры молекулярной массы; Б – контрольные белковые лизаты каждого организма; 1 (контроль), 2, 3, 4_37, 4_50 и 5 – пептидные пробы, полученные с использованием протоколов гидролиза 1–5 (табл. 1) соответственно

Скачать (573KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Количество белковых групп, идентифицированных по данным ВЭЖХ-МС1 (а) и ВЭЖХ-МС/МС (б) для клеток A549 (H. sapiens); побегов пшеницы (T. aestivum) и дрожжей (S. cerevisiae). Каждый столбец соответствует среднему значению по пяти независимым техническим повторам на уровне подготовки образцов. Столбцы с усами соответствуют среднему значению ± SD в 95%-ном доверительном интервале. Звездочками (*) обозначены статистически значимые изменения (t-критерий Стьюдента; p-value < 0,05) по сравнению с классическим гидролизом (красные заштрихованные столбцы). Обозначения оси абсцисс: 1 – классический 18-часовой гидролиз; 2 – УЗ-воздействие при повышенной температуре и сокращенном времени восстановления, алкилирования и гидролиза; 3 – гидролиз при повышенной температуре и сокращенном времени реакций восстановления и алкилирования; 4_37 – сокращенный классический гидролиз; 4_50 – гидролиз при повышенной температуре; 5 – СВЧ-воздействие с сокращенным временем восстановления, алкилирования и гидролиза

Скачать (473KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Эффективность ферментативного гидролиза, восстановления и алкилирования остатков цистеина для различных методов пробоподготовки на основе МС/МС-данных. а – Число цистеин-содержащих пептидов относительно общего числа идентифицированных пептидов для клеточной линии A549 (H. sapiens), побегов пшеницы (T. aestivum) и дрожжей (S. cerevisiae). б – Относительное количество пептидов с пропущенными сайтами гидролиза (0, 1, 2 и 3), рассчитанное на основе идентификации пептидов по МС/МС-данным для клеточной линии A549 (H. sapiens), побегов пшеницы (T. aestivum) и дрожжей (S. cerevisiae). Данные усреднены по пяти техническим репликам для каждого протокола. Столбцы с погрешностями соответствуют среднему ± стандартному отклонению в 95%-ном доверительном интервале. Звездочками (*) обозначены статистически значимые отличия (t-критерий Стьюдента; p-value < 0,05) при сравнении с классическим протоколом (обозначены символом «0»). Обозначения по оси абсцисс: 1 – классический 18-часовой гидролиз; 2 – УЗ-воздействие при повышенной температуре и сокращенном времени восстановления, алкилирования и гидролиза; 3 – гидролиз при повышенной температуре и сокращенном времени реакций восстановления и алкилирования; 4_37 – сокращенный классический гидролиз; 4_50 – гидролиз при повышенной температуре; 5 – СВЧ-воздействие с сокращенным временем восстановления, алкилирования и гидролиза

Скачать (423KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Пересечение идентификаций пептидов (а) и белков (б) в репликах на уровне пробоподготовки: анализ данных МС/МС. Каждый протокол применялся для подготовки образцов клеточной линии A549 (H. sapiens), побегов пшеницы (T. aestivum) и дрожжей (S. cerevisiae). Количество реплик: 4 (человек) или 5 (пшеница и дрожжи). Обозначения: 1 – классический 18-часовой гидролиз; 2 – УЗ-воздействие при повышенной температуре и сокращенном времени восстановления, алкилирования и гидролиза; 3 – гидролиз при повышенной температуре и сокращенном времени реакций восстановления и алкилирования; 4_37 – сокращенный классический гидролиз; 4_50 – гидролиз при повышенной температуре; 5 – СВЧ-воздействие с сокращенным временем восстановления, алкилирования и гидролиза

Скачать (493KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Оценка влияния протокола пробоподготовки с использованием СВЧ-воздействия на результаты безметочного анализа количественных стандартов смесей белков дрожжей и человека: данные ВЭЖХ-МС1-анализа. a – Количество идентифицированных белков в стандартах «человек–дрожжи», подвергнутых ферментативному гидролизу по классическому (18-часовому) протоколу 1 (красные столбцы) и протоколу с СВЧ-воздействием (фиолетовые столбцы). Обозначения по оси абсцисс соответствуют протоколу с СВЧ-воздействием (MW_) или классическому протоколу (CL_), а также названиям образцов с соотношением компонентов (N, N = 1–4) из табл. 2. б – Процент идентифицированных групп белков дрожжей в смесях «человек–дрожжи» в сравнении с процентным содержанием массы дрожжей в количественных стандартах (показано пунктирными линиями). Столбцы с усами отражают среднее значение ± стандартное отклонение при 95%-ном доверительном интервале; данные усреднены по четырем репликам (в–з). Диаграммы рассеивания для попарного сравнения количественных стандартов «человек–дрожжи» (N2/N1, N3/N1, N4/N1; табл. 2), подготовленных по классическому протоколу (в–д) и протоколу с СВЧ-воздействием (е–з). Пунктирные коричневые линии обозначают порог отбора дифференциально регулированных белков. Сплошные зеленые линии показывают фактическое кратное изменение концентрации белков (FC; log2-шкала), рассчитанное с использованием значений масс дрожжей из табл. 2. Белки человека и дрожжей показаны красными и фиолетовыми маркерами соответственно

Скачать (769KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025